現代生物制藥工藝核心技術

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樓主 2019-07-02 15:35:33
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本文將著重討論病毒污染的來源、法規對除病毒的要求、除病毒的途徑以及相關驗證方法等。


法規要求

病毒是一種具有細胞感染性的亞顯微粒子,它實質上是由一個保護性的外殼包裹的一段DNA或者RNA,這些簡單的生物體無法獨立生長和復制,但可以利用宿主的細胞系統進行自我復制,見表1。病毒在細胞外也能保持極強的生命力,病毒可以感染所有具有細胞的生命體。

長久以來,病毒威脅與人類的安全息息相關,一旦有不符合病毒安全的產品流入市場,將對客戶群體造成嚴重的危害,生產企業自身也必將會遭到法律的嚴厲制裁,見表2。因此,生物制品行業必須做好除病毒工藝。美國FDA規定,每百萬單位的產品中不能混有一個病毒顆粒,在I期臨床,企業需要對已知會對產品造成污染的病毒進行清除,這其中包括內源性病毒以及外源性病毒。內源性病毒往往伴隨著細胞系的表達而一同繁殖,它們主要由直徑在80~120nm左右的包膜病毒組成,MuLV鼠白血病病毒常作為該類病毒的除病毒驗證模板,這類病毒相對比較容易被去除或者滅活;外源性病毒往往經由生物原料、培養基等介質混入生產線,它們主要由直徑在20~50nm左右的非包膜病毒組成,MMV鼠細小病毒常作為該類病毒的驗證模板,這類病毒比較難去除或者滅活。在III期臨床,企業不僅需要對已知的內源性或外源性病毒進行滅活或去除,還需具備去除潛在病毒威脅的工藝。

目前,國際上主要采用對數減少值(LRV,Log Reduction Value)來描述病毒去除的程度,即:

例如,除病毒前料液中含有病毒106個,而完成除病毒步驟后含有病毒102個,則代入公式即得出:

對于內源性病毒,法規規定企業必須采用至少兩種正交步驟有效滅活或去除病毒,每一步的病毒去除率LRV不低于4,而總LRV需不低于12~15。對于外源性病毒,法規規定企業必須采用至少一種有效滅活或去除病毒的步驟,總LRV不低于6。對于去除潛在威脅的病毒,必須采用至少一種有效滅活或去除病毒的步驟,總LRV不低于4。此外,對于企業使用的除病毒工藝,法規規定其必須包含一種滅活工藝去除病毒、必須能夠去除包膜以及非包膜病毒,并且至少一種工藝對非包膜細小病毒有效。

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除病毒工藝


對于生物制藥企業而言,確保病毒安全往往通過三個途徑,首先是在生產流程的上游盡可能控制生物原料、培養基等材料的質量;然后嚴格按照法規的要求,在工藝的下游采取有效的除病毒步驟;最后,需要對產品灌裝前進行檢測,只有通過病毒檢測的產品才能被放行,圖1是某生物制藥企業典型的生物工藝流程。

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上游工藝病毒屏障??

首先要消除一些潛在的病毒污染的威脅,原材料及儀器設備必須通過相關的驗證,所采取的除病毒方法效率能達到3~6 LRV水平。同時,所采取的除病毒步驟必須不能影響產品,例如,某生產重組蛋白產品的企業,如果采用光滅活除病毒的方法,就必須要保證這種方法不會造成之后的細胞增殖受影響,否則產品的收率將會受到很大挑戰。企業還必須注意這些除病毒步驟所造成的成本是否合理,需要選取性價比最高的除病毒方法。除此之外,對于上游除病毒的方法還應該可以被驗證,一些除病毒過濾設備必須通過完整性測試,而且除病毒的工藝易于從小試放大到生產級別。表3列舉了在工藝上游的主流除病毒方法。


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下游工藝除病毒方法??

下游純化工藝中的除病毒步驟是病毒安全的主要途徑。主要有以下幾種方法。①低pH值法:通過降低料液的pH值,能夠高效地滅活料液中的病毒,尤其是顆粒較大的逆轉錄病毒,其缺點在于會降低部分蛋白活性;②層析法:通過使用層析柱,能夠對料液中的病毒進行親和層析,從而達到去除病毒的目的,但是較難驗證是這種方法的弊端;③化學添加劑:Ethanol,Iso Propanol,Tween? 80,Triton? X-100等化學試劑能滅活大部分病毒,但同樣會對蛋白活性造成影響;④過濾法:使用納米級別的過濾膜采用大小排除的方法,讓料液通過過濾膜并截留病毒,并且不影響蛋白活性,操作簡便、易于工藝放大。

目前,使用納米膜過濾病毒是非常主流的方法,也是對產品收率影響最少的方法,它不引入其它化學成份、不引入電荷、容易做驗證且操作簡便,其原理是針對蛋白料液及病毒顆粒直徑的大小進行篩選排除,大顆粒的病毒被截留在納米膜上,小尺寸的蛋白分子可以順利通過過濾膜。因此,純化工藝對過濾膜的有效孔徑分布要求非常高,如果小孔過多,則很有可能截留產品中的蛋白;如果大孔過多,則會讓病毒顆粒穿過,截留率下降。圖2是除病毒過濾膜孔徑的正態分布圖。


除病毒過濾器經歷了幾十年的演變,濾芯材料包括多層非對稱聚醚砜膜、對稱聚偏二氟乙烯膜和非對稱型聚醚砜膜,見圖3。目前,國際上主流采用非對稱設計的聚醚砜材料,該類材料的特點是料液載量大除病毒截留率高、耐酸堿腐蝕,并且流速快。

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過濾器的模式也從傳統的囊式過濾器、筒式過濾器向模塊化的過濾器模式發展見圖4,拋棄型模塊化的過濾器能更節省空間、可任意縮小、放大工藝規模,擁有更小的死體積,更節省沖洗用水和緩沖溶液,與此同時,操作也更加簡便。

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除病毒驗證


通過除病毒驗證的除病毒步驟才能得到法規認可。工藝開發工程師通常將哺乳動物病毒加入到蛋白溶液中,對病毒去除步驟(過濾、層析、熱處理或化學失活等)進行縮小規模的驗證實驗(Spiking Validation),從這個實驗可以看出病毒去除的效果,通常我們將LRV不低于4定義為有效的病毒去除步驟。此外,對于除病毒過濾來說,縮小規模除病毒驗證還可以確定某些工藝參數,如操作壓力、通量、單位面積濾膜的載量和通量衰減等,當然,這種實驗是假定縮小規模實驗和大規模生產在同樣條件下為前提的。法規規定除病毒驗證必須提供有效的實驗數據,從而證明企業所采用的除病毒步驟能夠充分滅活/去除已知的會對產品料液污染的病毒,或已知的可能會造成污染的病毒,提供間接的數據證明企業所采用的除病毒步驟能充分滅活/去除未知的或無法預計的病毒污染。

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病毒的選擇??

被用于除病毒驗證的病毒往往被分為相關類型、特定類型和非特定類型三種。相關模型病毒是內源性或外源性病毒自身,或者同種屬的病毒;特定類型病毒與內源或外源性病毒是不同種屬,但具有相似的理化性質;非特定類型病毒代表不同理化性質的各種不同病毒。

為了驗證去除特定內源性及外源性病毒,相關類型病毒常常作為首選,如果無法獲取或使用相關類型病毒,應使用與目標病毒最為接近的特定類型病毒用作驗證。為了驗證去除潛在病毒威脅,企業需要采用兩到三種非特定類型病毒作除病毒驗證。驗證中所采用的病毒往往需構成一組能反映不同病毒理化性質的數據,包括DNA病毒及RNA病毒、包膜病毒及非包膜病毒、不同大小和構型的病毒等。

病毒驗證經常選擇一些與工藝中可能引入的病毒大小相近的模式病毒。小鼠細小病毒是Parvoviridae家族的一種細小(18~26nm)、無包被的單鏈DNA病毒,屬于已在生物制藥生產過程(特別是在murine hybridoma和CHO表達系統中)被發現的外源污染,由于這種病毒非常小,而且被證明是有可能產生的外源污染,因此MMV經常被用來做病毒截留研究。

噬菌體也經常被應用于病毒截留機制的研究。噬菌體比較容易被純化至高滴度,而且其檢測方法相對簡單和快速(通常可在一天內完成)。噬菌體ΦX174是一個直徑為25~35nm、無包被的DNA病毒,屬于Microviridae,主要用來作為細小病毒的研究。

此外,在單抗生產工藝中,經常會用到一些逆轉錄病毒類似(Retrovirus-like particles, RVLPs)的細胞系,它會產生內源污染。Xenotropic murine leukemia virus(X-MuLV)是一種直徑為80~110nm、包被的單鏈RNA病毒,屬于Retroviridae家族,這種病毒經常用來作為RVLPs的模式病毒。

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病毒料液的影響

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除病毒驗證過程中使用的病毒液質量會顯著影響濾膜的過濾性能。粗制病毒液含有細胞碎片等雜質成分,這些成分的存在會使流速降低、載量下降,另外,流量衰減還會導致病毒(特別是細小病毒)發生穿透。 縮小規模實驗的目的是為了模擬生產過程,但粗制病毒液不能達到這個目的,在除病毒驗證實驗中,使用粗制病毒液會增加所需濾膜面積,提高生產者的成本,更嚴重的是,粗制病毒液會使濾膜堵塞機制復雜化,從而使病毒截留不能反映實際生產情況。

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病毒檢測的方法?

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常用的病毒檢測方法有細胞試驗,動物抗體產生試驗和雞胚感染試驗等。本章著重介紹國內針對鼠源性單克隆抗體制品的病毒檢測方法,鼠源性單克隆抗體需要作以下病毒屬組的檢測:

(1)病毒屬I組是指能夠感染人與靈長類動物的病毒,包括出血熱病毒、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒、III型呼腸孤病毒和仙臺病毒。

(2)病毒屬II組是指尚無跡象表明感染人的病毒,但它能在體外培養的人、猿和猴源性細胞中進行復制,對人類具有潛在危險性,包括脫腳病病毒,小鼠腺病毒,小鼠肺炎病毒和逆轉錄病毒。

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方法介紹

(1)供試品的準備:供試品包括雜交瘤細胞株、腹水和單克隆抗體半成品或成品。雜交瘤細胞株應進行細胞試驗、動物抗體產生試驗和雞胚感染試驗;腹水和單克隆抗體半成品或成品應進行動物抗體產生試驗和雞胚感染試驗。

(2)細胞試驗:用已知病毒抗體檢查供試品中未知病毒抗原。

①細胞培養:根據被檢測的病毒選擇其敏感的細胞,每種細胞6瓶,細胞應生長良好。用0.01mol/L pH7.4 PBS洗細胞2次,每瓶接種供試品0.3ml,每批供試品接種4瓶,另外2瓶為對照,37℃吸附1小時,棄去吸附的供試品液體,加入細胞維持液,每天觀察細胞形態,并記錄結果,接種后每隔3-4天換一次液,第1代細胞應維持10-14天,凍融3次后將對照組2瓶、供試品組4瓶分別合并,將收獲的對照組和供試品組的細胞懸液分別接種同種細胞,接種后,每隔3-4天換1次液。

②涂片:培養至10-14天,吸出維持液,再用PBS洗細胞2次,每瓶加消化液0.15mol,使細胞分散、脫壁、吸出細胞懸液,再用PBS洗滌2次。用適量的PBS懸浮細胞將對照組的正常細胞涂在抗原片的第1行,供試品組的細胞涂在第2行,吹干、丙酮固定,-40℃保存,即得供試品細胞涂片。

③間接免疫熒光法檢測:制備已知病毒抗原片,將已知特異性陽性血清和陰性血清進行1:5~1:20 的稀釋,應用制備的已知病毒抗原片作為血清對照,檢查供試品細胞圖片。將涂有供試品細胞的玻片加經PBS10倍稀釋的已知陽性血清和陰性血清,置濕盒中,37℃放置30分鐘后用PBS洗滌3次,每次浸泡5分鐘,待干燥后滴加熒光抗體,37℃保溫30分鐘后用PBS洗滌3次,每次浸泡5分鐘,再用水洗1次,待干燥后加50%甘油,用蓋玻片封好,鏡檢。

④結果判定:在已知病毒抗原片上,陰性對照血清與正常細胞孔、病毒細胞孔無熒光,陽性對照血清與正常細胞孔無熒光,與病毒細胞孔有熒光;在供試品細胞涂片上,陰性對照血清與正常細胞孔、供試品細胞孔無熒光,陽性對照血清與正常細胞孔無熒光時,試驗成立。陰性對照血清與正常細胞孔和供試品細胞孔有熒光反應或陽性對照血清與正常細胞孔有熒光反應,試驗不成立。供試品細胞涂片上,陽性對照血清與供試品細胞孔有熒光,判為陽性。

(3)動物抗體產生試驗

①供試品抗體的制備:每批供試品按表4參數值注射無特定病原體小鼠(BALB/C或KM)共50只。

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②血清學檢查:對經肌內注射和腹腔注射的供試品組和對照組小鼠分別采血,分離血清后用ELISA法檢測抗體,包被病毒抗原和正常細胞抗原,每孔0.1ml,置37℃培養,1小時后,放4℃過夜,用洗液充分洗滌、拍干。每份供試品分別加入病毒抗原孔和正常細胞抗原孔各1個,37℃培養1小時,用洗液充分洗滌,拍干。每孔加入底物溶液0.1ml,37℃維持10-20分鐘,當陽性血清對照孔出現顏色,陰性對照孔無顏色時,每孔加入1mol/L硫酸溶液0.1ml終止反應,測吸光度。

結果判定:P/N值不小于2.1為陽性;P/N值在1.5-2.0為可疑;P/N值小于1.5 為陰性。其中:P為供試品免疫小鼠血清與病毒抗原的吸光度減去供試品免疫小鼠血清與正常細胞抗原的吸光度;N為對照組動物血清與病毒抗原的吸光度減去對照組動物血清與正常細胞抗原的吸光度。

(4)雞胚感染試驗:于接種前24小時觀察雞胚,活雞胚具有清晰的血管和雞胚暗影,較大雞胚還可看到胚動;死胚血管暗昏模糊,沒有胚動。接種前用檢卵燈再次檢查雞胚活力,并標出氣室和胚胎的位置。按無菌操作要求,以卵黃囊、尿囊腔和絨毛尿囊途徑接種供試品;接種后,每日觀察,培養5天;無菌操作收集卵黃囊、絨毛尿囊膜和尿囊液;卵黃囊和絨毛尿囊膜經研磨后,離心,取上清液,與尿囊液分別用豚鼠或雞紅細胞做凝血試驗。

取每排8孔微量血凝反應板,從第二孔至第8孔每孔加生理氯化鈉溶液50ul。第1、2孔各加經上述處理的供試品50μl,然后從第2孔吸取50μl至第3孔,第3孔吸取50μl至第4孔(以此類推)進行倍比稀釋,至第7孔時丟棄50μl,第8孔為對照孔。第1孔至第8孔各加1%豚鼠紅細胞懸液50μl,混勻,做2塊反應板,分別靜置于4℃和室溫,至對照孔呈現明顯陰性時判定結果。

結果判定:++++紅細胞均勻鋪于孔底;+++ 紅細胞均勻鋪于底孔,但邊緣不齊,有下滑趨向;++紅細胞于孔底形成小環,但周圍有小凝集塊;+紅細胞集中在孔底中央,呈一邊緣致密的紅點。以凝集反應出現“++”或“++”以上者判為陽性。

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